基因組編輯技術(shù)是生命科學領域的顛覆性技術(shù)，為生物學基礎研究和應用研究奠定了堅實的技術(shù)基礎。歷經(jīng)十余年的不斷迭代和迅猛發(fā)展，基因組編輯技術(shù)經(jīng)歷了如下兩個階段：第一階段以CRISPR-Cas9技術(shù)為代表，利用序列特異性核酸酶良好的靶向性和可編程性，在基因組特定位置產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，繼而通過細胞內(nèi)源修復機制產(chǎn)生隨機、不可控的小片段插入或刪除，達到基因敲除的目的。第二階段包括堿基編輯技術(shù)和引導編輯技術(shù)的開發(fā)與應用。堿基編輯技術(shù)能夠在不依賴DNA雙鏈斷裂的情況下實現(xiàn)特定堿基的高效精準替換，而引導編輯更是能夠精準實現(xiàn)堿基的任意形式突變以及小片段DNA的精準插入或刪除，大幅提升了基因組編輯的精準性，極大地拓寬了技術(shù)的應用范圍。上述技術(shù)的疊加使得科學家們能夠高效、快速并準確地實現(xiàn)基因敲除、堿基定向突變及少量核苷酸的插入或刪除等小片段DNA水平的精準操縱。隨著生物領域研究的快速發(fā)展，小片段DNA的編輯已經(jīng)不能滿足研究和應用的需要。新的需求正引領基因組編輯技術(shù)突破DNA操縱長度的限制，邁入第三階段：即實現(xiàn)kb級大片段DNA甚至是染色體水平的精準編輯。然而，目前能夠?qū)崿F(xiàn)大片段DNA精準操縱的基因組編輯工具還十分有限，尤其在植物研究領域，相關(guān)工具還未見報道。

　　近日，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞研究組開發(fā)了PrimeRoot (Prime editing-mediated Recombination Of Opportune Targets)技術(shù)，通過系統(tǒng)整合優(yōu)化的引導編輯工具和位點特異性重組酶系統(tǒng)，實現(xiàn)長達11.1 kb的大片段DNA的高效精準定點插入。研究人員首先通過結(jié)合該實驗室開發(fā)的ePPE（Engineered Plant Prime Editor）（Zong et al., Nature Biotechnology, 2022）以及David Liu實驗室研發(fā)的epegRNA（Engineered pegRNA）（Nelson et al., Nature Biotechnology, 2021）在植物細胞內(nèi)建立了dual-ePPE系統(tǒng)，實現(xiàn)了最高效率可達50%以上的短片段DNA的精準定點插入，繼而使用熒光報告系統(tǒng)在水稻原生質(zhì)體中評估了分屬絲氨酸家族和酪氨酸家族的8種位點特異性重組酶的工作效率，最終將dual-ePPE與篩選出的高效的酪氨酸家族位點特異性重組酶Cre相結(jié)合，開發(fā)了能夠?qū)崿F(xiàn)大片段DNA精準插入的PrimeRoot系統(tǒng)。該系統(tǒng)在水稻和玉米中能夠?qū)崿F(xiàn)一步法大片段DNA的精準定點插入，效率可達6%，成功插入的片段長度最長達11.1kb。相比于傳統(tǒng)非精準的非同源末端連接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 策略，PrimeRoot插入5kb及以上DNA片段的效率有明顯提升，且插入完全精準可預測，在編輯效率和精準性上具有顯著優(yōu)勢。

　　該工作中還展示了PrimeRoot介導的大片段DNA精準定點插入的兩個具體應用場景：啟動子的原位插入是基因功能研究以及新性狀創(chuàng)制的重要途經(jīng)，研究人員利用PrimeRoot在水稻HPPD基因的5‘UTR區(qū)精準插入了Actin啟動子（1.4kb），成功實現(xiàn)了啟動子序列在功能基因UTR區(qū)域的原位插入；外源功能基因的導入是賦予作物新性狀的主要手段之一，而傳統(tǒng)基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因方式插入位置隨機且不精準，往往導致內(nèi)源功能基因的破壞或外源插入基因表達水平不穩(wěn)定，使得理想種質(zhì)的篩選過程繁雜冗長，PrimeRoot大片段DNA精準定點插入為解決這一問題提供了全新方案。研究人員首先通過生物信息學分析預測出了水稻內(nèi)33個可用于外源基因插入的基因組安全港（Genomic safe harbor, GSH）區(qū)域。全基因組測序分析表明，傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導的T-DNA插入是完全隨機不精準的，且無33個GSH內(nèi)的插入事件。相比之下，PrimeRoot介導的插入能夠完全精準定點地落入指定的安全港區(qū)域且在全基因組范圍內(nèi)檢測不到可預測的脫靶事件。在此基礎上，作者使用PrimeRoot將稻瘟病抗性基因pigmR精準插入到預測的GSH內(nèi)實現(xiàn)了快速抗病育種。最后，為了進一步提高PrimeRoot的效率，作者在水稻中建立了PrimeRoot組分和插入DNA組分的連續(xù)轉(zhuǎn)化體系，該體系下大片段DNA精準插入的效率相較于一次轉(zhuǎn)化提高了2-4倍，插入Actin啟動子（1.4kb）的效率達8.3%，插入pigmR基因表達框（4.9kb）的效率達6.3%。

　　綜上所述，研究人員通過工程化結(jié)合引導編輯器與位點特異性重組酶，開發(fā)了能夠在植物中實現(xiàn)10kb以上大片段DNA高效精準定點插入的PrimeRoot系統(tǒng)，該系統(tǒng)將為基于基因堆疊的植物分子育種和植物合成生物學研究提供有力的技術(shù)支撐。相關(guān)研究成果于2023年4月24日在線發(fā)表于Nature Biotechnology雜志（DOI:10.1038/s41587-023-01769-w.）。高彩霞研究組博士生孫超、雷源和李帛樹為本文的共同第一作者，高彩霞研究員與北京齊禾生科生物科技有限公司的Kevin Zhao博士為本文共同通訊作者。中國農(nóng)業(yè)大學劉俊教授、中科院遺傳發(fā)育所王延鵬研究員參與了該研究。該研究得到國家重點研發(fā)計劃項目、中國科學院戰(zhàn)略重點項目、中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家自然科學基金委等的經(jīng)費資助。

　　圖：PrimeRoot編輯器的建立及優(yōu)化

　　a， PrimeRoot編輯器的原理及模式示意圖

　　b， 不同構(gòu)建形式的PrimeRoot在水稻和玉米中的編輯效率

　　c， 連續(xù)轉(zhuǎn)化法介導的高效PrimeRoot示意圖