基因編輯技術(shù)在植物中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用為分子設(shè)計(jì)育種帶來(lái)了革命性的變化?；诨蚓庉嫾夹g(shù)建立基因精細(xì)調(diào)控的方法對(duì)于精準(zhǔn)設(shè)計(jì)育種至關(guān)重要。目前應(yīng)用最為廣泛的基因表達(dá)調(diào)控方法，如CRISPR-Cas、CRISPRi和RNAi等技術(shù)只能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因的完全敲除或?qū)⒒虻谋磉_(dá)抑制到不可預(yù)測(cè)的水平。利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行編輯，可以在轉(zhuǎn)錄層面將基因的表達(dá)調(diào)控至不同的水平，并產(chǎn)生大量不可預(yù)測(cè)的數(shù)量性狀變異。但這種方法將耗費(fèi)大量精力用以篩選理想的突變體。因此，開(kāi)發(fā)新的能夠可預(yù)測(cè)地精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)的方法可以極大拓展現(xiàn)有的基因表達(dá)調(diào)控工具箱，為作物遺傳改良提供有力的技術(shù)支撐。 

　　上游開(kāi)放閱讀框(upstream open reading frame, uORF)是真核生物mRNA上普遍存在的翻譯調(diào)控元件，對(duì)基因主效開(kāi)放閱讀框(primary open reading frame, pORF)的翻譯具有抑制作用。2018年，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組率先利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)uORF進(jìn)行編輯，建立了精細(xì)上調(diào)內(nèi)源基因翻譯的方法，并利用該方法培育出了維生素C含量顯著提高的生菜種質(zhì)(Zhang et al., Nat. Biotechnol., 2018; Si et al., Nat. Protoc., 2020)。2020年，高彩霞研究組又將這一技術(shù)應(yīng)用于草莓的遺傳改良，獲得了梯度糖分的系列草莓新種質(zhì)(Xing et al., Genome Biol., 2020)。近日，高彩霞研究組基于此前研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了能夠可預(yù)測(cè)地精細(xì)下調(diào)目標(biāo)基因蛋白表達(dá)的新方法。 

　　uORF的長(zhǎng)度及uORF與pORF之間的距離等多種因素都會(huì)影響uORF對(duì)pORF翻譯的抑制能力。因此，研究人員猜想可通過(guò)以下兩種策略抑制目標(biāo)基因的翻譯：第一種是在目標(biāo)基因的5’ 非翻譯區(qū)(5' untranslated region, 5’ UTR)從頭產(chǎn)生新的uORF；第二種是原位突變內(nèi)源uORF的終止密碼子以延伸其表達(dá)框長(zhǎng)度。原生質(zhì)體瞬時(shí)系統(tǒng)的結(jié)果表明這兩種策略可以有效地將pORF的翻譯抑制到不同的水平，且對(duì)其mRNA的表達(dá)量幾乎沒(méi)有影響。此后，研究人員利用堿基編輯和引導(dǎo)編輯系統(tǒng)獲得了含有新創(chuàng)制uORF或內(nèi)源uORF被延伸的水稻突變體植株，通過(guò)對(duì)突變體植株的蛋白表達(dá)水平和表型進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變體中引入的uORF變體對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)和表型的影響與瞬時(shí)系統(tǒng)結(jié)果一致。 

　　為了實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行連續(xù)的梯度下調(diào)，本研究結(jié)合以上兩種策略，分別在水稻的OsTCP19, OsTB1和OsDLT基因的5’ UTR區(qū)域設(shè)計(jì)了一系列具有不同抑制能力的uORFs，瞬時(shí)系統(tǒng)的結(jié)果表明pORF的翻譯水平被梯度地抑制到了原始水平的2.5-84.9%，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因的梯度敲降。OsDLT基因編碼GRAS蛋白家族成員，參與了水稻油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控水稻株高、分蘗數(shù)、種子大小等多個(gè)重要農(nóng)藝性狀。該研究中以OsDLT基因?yàn)榘袠?biāo)，通過(guò)編輯OsDLT基因的5’ UTR，獲得了一組具有不同葉夾角、株高和分蘗數(shù)的突變體，且突變體的表型變化趨勢(shì)與瞬時(shí)系統(tǒng)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。 

　　綜上所述，該研究通過(guò)對(duì)uORF進(jìn)行設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)了一種普適的能夠可預(yù)測(cè)地精細(xì)下調(diào)基因表達(dá)的新方法，為未來(lái)的分子設(shè)計(jì)育種提供了重要的技術(shù)手段。相關(guān)研究成果于2023年3月9日在線發(fā)表于Nature Biotechnology雜志（DOI:10.1038/s41587-023-01707-w）。高彩霞研究組博士后薛郴銷(xiāo)為該論文的第一作者，高彩霞研究員為通訊作者。該研究得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略重點(diǎn)項(xiàng)目、中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等的經(jīng)費(fèi)資助。 

　　圖：通過(guò)編輯uORF培育具有目標(biāo)性狀的水稻植株。 

　　(a, b)從頭創(chuàng)制新的uORFs (a)或延伸內(nèi)源uORFs (b)抑制目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)。 

　　(c)通過(guò)產(chǎn)生一系列具有不同抑制能力的uORFs梯度下調(diào)基因的表達(dá)。 

　　(d, e)含有uORFs變體的突變體對(duì)油菜素內(nèi)酯的敏感性(d)和植株表型(e)。